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讓我們一起來了解一下亞克隆技術

  • 發布日期:2019-03-25      瀏覽次數:1611
    •   亞克隆技術是指在得到基因DNA片段的情況下,對其進行重新克隆,從而對目的基因DNA進行進一步的分析或者重組改造等。亞克隆技術也是分子克隆技術,這項技術的出現能夠讓人們對基因DNA序列有更深入的研究,明確基因的功能,從基因角度對生物體表型進行分析。
        亞克隆的技術流程主要分成四個步驟:目的片段的獲取、酶切載體與目的片段的連接、轉入宿主細胞和鑒定篩選。
        目的片段的獲取
        獲得目的片段的方法有以下幾種方法:1、從基因文庫中直接獲取目的基因片段;2、運用PCR技術,以mRNA為模板逆轉錄而成cDNA序列,從而得到cDNA文庫獲取目的基因;3、使用限制性內切酶將供體DNA切成許多片段后導入到細胞中,經過篩選后得到含有目的基因的細胞;4、獲得基因序列信息,在體外進行人工合成。
        酶切載體與目的片段的連接
        選擇適宜的限制性核酸內切酶對載體目的片段序列進行剪切,通常情況下,會產生對稱性粘性末端、不對稱粘性末端和平末端三種情況。亞克隆實驗中優先采用的是不對稱粘性末端連接,可將外源DNA定向插入到載體中。
        轉入宿主細胞
        將連接了目的基因的載體轉入到細胞中通常有轉化/轉染以及轉導兩種方法。轉化/轉染是將重組質粒或噬菌體轉入到經過處理的宿主細胞中;轉導的方法是利用攜帶外源DNA的病毒類侵染宿主細胞。通常情況下,相比于轉化的方法,轉導的效率更高一些。
        鑒定篩選
        克隆細胞的篩選通常選用直接篩選的方法。載體帶有可辨識的遺傳標記,能夠有效的將重組分子與原有細胞進行區分和分離。有些載體分子攜帶外源基因后,形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化,如藍色變為無色,明顯的顏色表型變化能夠讓重組分子得到明確的區分。除此之外,還有一些其他的藥物篩選方法等,都可以比較簡單的通過表型現象對克隆細胞進行有效的篩選。
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